核心提示： 微生物長期受到外界的影響，遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進(jìn)化。然而由于突變的存在，菌種
 

　　微生物長期受到外界的影響，遺傳性狀必然發(fā)生某些變異。正是由于變異的存在才使得生物向前進(jìn)化。然而由于突變的存在，菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，可能會出現(xiàn)某些優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記丟失、典型特征改變等現(xiàn)象，稱為菌種衰退。比如蘇云金芽孢桿菌由于菌種衰退，導(dǎo)致其新生的菌體芽孢和伴孢晶體都比較??；保藏的沙門氏菌鞭毛抗原丟失，導(dǎo)致H多價(jià)血清不凝固等。
 

　　01
 

　　菌種衰退原因
 

　　菌種衰退的根本原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發(fā)生自發(fā)突變。雖然自發(fā)突變的幾率很低(一般為10-6~10-9)，尤其是對于某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由于微生物具有的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細(xì)胞的數(shù)目就會不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，最終成為一株衰退了的菌株。此外，菌種衰退還有以下幾種原因：
 

　　1、表型延遲造成菌種衰退
 

　　表型延遲現(xiàn)象也會造成菌種衰退。如，在誘變育種過程中，經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了。
 

　　2、質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退
 

　　質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)?？刂频?。當(dāng)菌株細(xì)胞由于自發(fā)突變或外界條件影響(如高溫)，致使控制產(chǎn)量的質(zhì)粒脫落或者核內(nèi)DNA和質(zhì)粒復(fù)制不一致，即DNA復(fù)制速度超過質(zhì)粒，經(jīng)多次傳代后，某些細(xì)胞中就不具有對產(chǎn)量起決定作用的質(zhì)粒，這類細(xì)胞數(shù)量不斷提高達(dá)到優(yōu)勢，則菌種表現(xiàn)為衰退。
 

　　3、連續(xù)傳代
 

　　連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變(尤其是負(fù)突變)的幾率越高；另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個(gè)別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。
 

　　4、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件
 

　　不適宜的培養(yǎng)和保藏條件是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。不良的培養(yǎng)條件如營養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發(fā)衰退型細(xì)胞的出現(xiàn)，還會促進(jìn)衰退細(xì)胞迅速繁殖，在數(shù)量上大大超過正常細(xì)胞，造成菌種衰退。
 

　　02防止菌種衰退措施
 

　　采用已衰退菌種進(jìn)行生產(chǎn)會影響生產(chǎn)效率，而把已衰退菌種作為陽性菌株進(jìn)行檢驗(yàn)，則會影響檢驗(yàn)正確率。既然變異是不可避免的，那么我們應(yīng)該如果避免菌種衰退呢？
 

　　1、控制傳代次數(shù)
 

　　盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代減少到的水平以減少突變幾率。傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的幾率就越大，菌種發(fā)生衰退的機(jī)會就越高。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)或者是生產(chǎn)實(shí)際中，應(yīng)嚴(yán)格控制傳代次數(shù)。中國藥典當(dāng)中規(guī)定，培養(yǎng)基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代，以防止菌株因傳代次數(shù)過多引起衰退影響檢驗(yàn)。
 

　　2、利用不同類型細(xì)胞進(jìn)行接種傳代
 

　　放線菌，霉菌用菌絲進(jìn)行移種比分生孢子容易衰退，因菌絲是對核且有異核存在，所以移種霉菌適宜采用孢子。
 

　　3、良好的培養(yǎng)條件
 

　　不良的培養(yǎng)條件會衰退細(xì)胞的出現(xiàn)，因此采用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培養(yǎng)，以減少衰退幾率
 

　　4、采用有效的菌種保藏方法
 

　　根據(jù)保存時(shí)間的長短，選擇適宜的保存方法。
 

　　傳代培養(yǎng)法：復(fù)蘇后的第一代放于4℃冰箱或室溫保存，定期傳代培養(yǎng)。保藏時(shí)間依微生物種類而定。如，芽孢、霉菌、酵母菌保存6個(gè)月轉(zhuǎn)一次，普通細(xì)菌1個(gè)月轉(zhuǎn)一次，假單胞菌2周轉(zhuǎn)一次
 

　　甘油凍存法：將復(fù)活后經(jīng)過性能確認(rèn)的菌株新鮮培養(yǎng)物(一般是第二代菌株)，用0.85%的滅菌生理鹽水(約1-2ml)洗斜面菌苔成菌懸液；將上述菌懸液吸取適量于滅菌管(凍存管)中(如，滅菌管容量為5ml，則取1.5ml菌液)，加入等體積的40%滅菌甘油，混勻，密封。保藏溫度為—20℃，一般可保存1-2年。
 

　　瓷珠保存管保存：菌株保藏管內(nèi)含特制的小珠(20-25顆)和特殊溶液，只需將培養(yǎng)好的菌株接入溶液中，搖勻成菌懸液，細(xì)胞即吸附于小珠上，然后吸出溶液，將保藏管置-70℃可保存5年，置-20℃可保存2-3年。
 

　　小貼士
 

　　瓷珠保存管保存具體操作：
 

　　第一步：對需要保存的菌株進(jìn)行必要的純化，挑取生長旺盛時(shí)期的菌落，接入菌株
 

　　保藏管中，通常需要接入4-7環(huán)，對于苛養(yǎng)菌應(yīng)多接一些；
 

　　第二步：擰上蓋子，充分劇烈震蕩；
 

　　第三步：用無菌吸管將溶液吸走，盡可能吸干；
 

　　第四步：馬上放入冰箱中，溫度越低越有利于保存(推薦使用-70℃超低溫冰箱)；
 

　　第五步：復(fù)蘇時(shí)，只需將小珠在平板上滾動或置肉湯中培養(yǎng)。